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CRISPR/Cas9基因编辑技术服务
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CRISPR/Cas9基因编辑技术服务



北京孚博生物提供CRISPR/Cas9基因编辑技术服务。


CRISPR/Cas9服务项目


gRNA合成服务

CRISPR/Cas9载体构建

Cas9载体活性验证

CRISPR基因敲除细胞株构建

CRISPR基因敲入细胞株构建




CRISPR/Cas9技术简介

CRISPR(clustered,regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具,又进行了优化和改造。Cong, L.等人在不影响系统效率的情况下,将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化,CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素:Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。


CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割,造成DNA双链断裂(DSB, double strand break)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制,主要包括两种途径:是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ,Non-homologous end joining),此修复机制非常容易发生错误,导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel),从而造成移码突变,最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变,从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现,使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物,且已成功应用于小鼠、大鼠、猪、灵长类、果蝇等等。DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR, homology-directedrepair),这种基于同源重组的修复机制保真性高,但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下,靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑,如:条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。

到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等,从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变,另外一方面其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗,如 HIV HBV等RNA病毒引起的疾病治疗研究,单基因或多基因遗传病治疗研究,癌症治疗研究等方面。CRISPR/Cas相比其它基因组编辑技术,如锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs),操作更简单,同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑,该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全,毒性更低的新方法。

CRISPR技术运用

CRISPR技术可运用于各种细胞,各个物种基因敲除,敲入,修饰或突变等,另外利用失去核酸酶活的Defect Cas9与不同功能结构域融合,可以实现基因干扰,激活,染色体染色,特定DNA纯化等特殊功能。

1、基因敲除(Gene Knockout)

利用双剪切或同源重组直接移除miRNA/lncRNA基因序列或蛋白编码基因的关键外显子,使其发生移码突变,从而使靶基因功能完全丢失。

2、基因敲入(Gene Knockin)
通过基因断裂诱导的同源重组,选择性将靶基因敲入Rosa26位点(人细胞选择敲入类似基因THUMPD3-AS1),靶基因可以是小RNA,lncRNA或蛋白编码基因,条件性敲入还可实现基因表达的实时控制。

3、基因修饰/突变(Gene Modification/Mutation)
通过基因断裂诱导的同源重组,可以在原基因中插入报告基因或标签序列,实现目的基因的检测、追踪和功能研究;也可以改变原有基因的编码序列来研究其对基因功能的影响。

4、基因编辑以外的运用(Other Applications)
利用dCas9(Defect Cas9)与特殊功能蛋白结构域的融合表达,还可使其发挥特殊功能。与转录激活或转录抑制蛋白结构域的融合表达,还可实现特定基因的过表达或干扰;与荧光蛋白的融合表达,可用于染色体染色;与表面抗原的融合,可用于纯化特定基因组片段等。

CRISPR/Cas9操作步骤

1.  靶基因分析:根据靶基因的名称和种属信息,在NCBI、Ensembl Genomes或其他分子生物学网站上进行查找,搜索到该基因的信息,并明确CDS外显子部分;

2.  sgRNA位点设计:确定待敲除位点,对于蛋白编码基因,如果该蛋白具有重要结构功能域,可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子;如果不能确定基因产物性质,可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA,可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。选择好要设计的区域后,再通过预测网站进行序列预测。序列预测的目的主要是避免Cas9脱靶效应,以确保设计的sgRNA尽可能的减少脱靶效应;

3.  Cas9载体构建:根据sgRNA序列,安排引物合成。引物合成时,需要在引物的5’端引入粘性末端。将引物退火形成带粘性末端的双链片段,取1ul用于后续的连接反应,其余在-20℃下保存。对表达载体先进行限制性内切酶酶切,得到线性化载体,再把前面得到的双链片段连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定;

4.  Cas9载体活性检测:对于构建的Cas9载体,转染细胞进行重组效率的检测,检测的方法主要是采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理,这一方法可以特异、定量的检测基因组重组效率。


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