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噬菌体展示技术原理


噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆 入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,以利于靶分子的识别和结合。


肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。


筛选到的高度亲和力的噬菌体集合中可能含有多种外源蛋白,可以利用ELISA或Western Blot进一步对得到的外源蛋白 进行筛选,或对蛋白进行铺盘分离单克隆菌株,得到特异性的单克隆抗体等,进行生物学方面研究。



噬菌体展示系统


1.   单链丝状噬菌体(M13)展示系统

1) PⅢ展示系统

pⅢ蛋白位于噬菌体的一端, 5个拷贝, 球形或线形, 406个氨基酸残基, 分为3个结构域N1、N2和CT, pⅢ蛋白介导噬菌体感染过程起始于pⅢ蛋白之N2结构域先结合到菌毛顶端, 随后N1结构域与宿主细菌细胞周质空间的TolA蛋白相结合。在pⅢ蛋白的两个位点(N1结构域和CT结构域)上均可实现外源蛋白的融合展示。


2) PⅧ及其他展示系统。

PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白,位于噬菌体外侧,C端与DNA结合,N端伸出噬菌体外,每个病毒颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽,但不能融合更长的肽链,因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配,使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时,可提供野生型PⅧ蛋白,降低价数,此时可融合多肽甚至抗体片段。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面,可以作为外源蛋白的融合位点,可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。


2.   λ噬菌体展示系统

1)PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分,该管状结构由32个盘状结构组成,每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域,C端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶(5 ku)和植物外源凝血素BPA(120 ku)等。λ噬菌体的装配在细胞内进行,故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。

2)D蛋白展示系统。D蛋白的分子质量为11 ku,参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明,D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可作为外源序列融合的载体,而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外,体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面,而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中,从而补偿溶源菌所缺的D蛋白,通过热诱导而组装。

3.    T4噬菌体展示系统

T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质,分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面,因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化,避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配,不需通过分泌途径,因而可展示各种大小的多肽或蛋白质,很少受到限制。吴健敏等成功地将大小约215 aa SOC/m E2融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面[14]。令人值得关注的是,SOC与HOC蛋白的存在与否,并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面,事实上,在DNA包装被抑制时,T4是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。因此,在用重组T4做疫苗时,它能在空衣壳表面展示目的抗原,这种缺乏DNA的空衣壳苗,在生物安全性方面具有十分光明的前景




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